<nav id="oc44y"></nav>
<menu id="oc44y"></menu>
<optgroup id="oc44y"></optgroup>
  • <xmp id="oc44y"><menu id="oc44y"></menu>
    <menu id="oc44y"><strong id="oc44y"></strong></menu> <xmp id="oc44y"><nav id="oc44y"></nav>
    <xmp id="oc44y">
  • pTO-T快速克隆试剂盒
    产品说明

      产品概述:

             pTO-T快速克隆试剂盒利用拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将片段克隆到载体中。适用于克隆由Taq DNA聚合酶扩增的3'端带有“A”末端的产物。载体元件包含高拷贝的复制子,Amp抗性基因,可以用引物对M13F(-47)和M13R(-48)进行菌落PCR鉴定阳性克隆。

      产品组成:

      组成

      CL05020

      CL05060

      2×pTO-T Mix

      (每5ul Mix30ng载体pTO-T

      100ul

      100ul×3

      Control Insert

      5ul

      5ul

      M13F引物(10uM)

      50ul

      150ul

      M13R引物(10uM)

      50ul

      150ul

      产品特点:

    • 连接反应仅需5分钟
    • 体系配置简单,只需加入片段和pTO-T Mix
    • 适用于Taq DNA聚合酶扩增的3'端带有“A”末端的产物
    • 具有氨苄青霉素
    • 无需蓝白斑筛选,阳性率大于90%
    • 质量控制检测 :

             使用本试剂盒连接Control Insert(1kb),涂布于A抗性平板上,用菌落PCR或质粒酶切方法验证次日长出的克隆,阳性克隆达到总克隆数90%及以上。

      贮存

             -20℃保存12个月,避免反复冻融

      使用说明

      1、连接反应

          按下表,在一个0.2ml PCR管内依次加入

         

      2、反应温度及片段要求

             室温下(20℃-30℃)放置5~10分钟,然后将离心管放置在冰上。当天如不进行转化实验,请将连接产物置于-20℃保存。注意DNA片段的用量见下表:

          

             如果PCR产物电泳检测仅有单一条带,无引物二聚体和非特异性条带存在,可直接取产物原液进行克隆。

      3、阳性对照反应

             取5ul试剂盒提供的1kb长度的对照片段进行克隆。

      4、 转化


    • 取10ul连接产物到100ul刚刚融化的DH5a或TOP10感受态细胞中(不建议使用TOP10F`感受态细胞),轻轻混匀,冰浴10-30分钟。
    • 42℃水浴中热击90秒。
    • 立刻置于冰水浴中2分钟。
    • 加入500ul无菌的不含抗生素的SOC或LB液体培养基,37℃,200-250rpm振荡培养60分钟。
    • 吸取200ul菌液涂布。为了得到更多的菌落,可以先4000rpm离心1分钟,去掉部分上清,用移液器轻吹菌体,充分悬浮菌液,取全部菌液涂布,然后37℃培养过夜(12-16小时)

    • 5、 阳性重组子的鉴定

             菌落PCR
             用10ul枪头挑选克隆至预先加有10ul无菌水或LB培养基的PCR管中,吹打混匀。取2ul细菌悬液为模板,50ul PCR体系中加入10uM浓度的M13F/M13R各1ul进行PCR扩增。
             1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果。电泳条带大小与插入片段大小相近(由于M13引物在克隆位置的两侧,所以PCR扩增出的DNA的长度比插入片段大156bp)的克隆可视为阳性克隆。菌落PCR鉴定重组体时一定要设立一个不加菌液的阴性对照,以排除PCR扩增的条带为假阳性的可能。
             测序:用M13F和M13R对阳性克隆的质粒进行测序分析。

      常见问题分析:

      转化次日平板克隆少,或阳性率低?


    • 感受态效率低,使用转化效率>5×107 cfu/ug的感受态细胞。
    • 连接反应在低温下操作,应当在室温下操作。
    • 连接反应时间过长,室温下5分钟就可以,时间过长,连接效率会下降。
    • PCR片段加入量太多或太少,按照推荐量加入。
    • PCR纯度低,切胶时在紫外灯下照射时间长,需重新制备。
    • PCR扩增结束后,应该再延伸5-10分钟,确保片段延伸完全。
    • 转化后没有复苏培养,可以加入SOC或LB液体培养基,培养60分钟。
    • 克隆基因可能对宿主菌有毒性,比如某些编码膜蛋白和DNA结合蛋白的基因,某些启动子和调节序列基因,或含有倒置或串联重复序列的基因,选用25-30℃室温过夜培养,或者选择转化能够有效针对毒性基因的EPI400感受态细胞。

    • pTO-T载体图谱和多克隆位点序列

    产品内容
      产品名称 产品编号 规 格 单位 价格(RMB)
      pTO-T CL05020 20次 500元
      pTO-T CL05060 60次 1380元
             
      说明书
    订购信息
    下载产品订购表或产品订购合同并按要求填写后发送至sales@generalbiol.com,公司收到订单或产品订购合同会及时与您回复及确认,并安排相关人员生产发运。
    • 订单或合同下载 为保证您的订单或订购合同顺利上传,请您下载最新订单或订购合同。
    • 邮箱:sales@generalbiol.com
    • 电话: 0550-3721555
    • 传真:0550-3721086
    在线客服
    手机购彩网 <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <蜘蛛词>| <文本链> <文本链> <文本链> <文本链> <文本链> <文本链>